由于测序和RT-qPCR原理不同，所以sequencing和RT-qPCR计算出来的变化倍数不可比，只要变化趋势相同就算结果一致。
四、选哪段
到IGV里查看wig文件，哪个区段峰高，并且在组间变化明显，就选哪段设计PCR引物。
lncRNA某些区域可能看不到read，这可能是以下原因导致的：1. 基因有不同isoform，在你的样品里可能只表达其中一种isoform；2. PCR或测序偏好；3. 基因结构注释有问题。
RNA-seq计算lncRNA表达量和筛选差异基因时，用的是lncRNA全长read counts的总和，不代表每个区段都有表达或表达差异。因此，选择高峰所在的区段做qPCR，能保证万无一失。
举例子
在IGV里面打开wig文件qpcr引物设计原则和注意事项，在IGV里逐个搜索满足上述原则的lncRNA，查看read分布。
栗子一
下图这个lncRNA位于基因间区，有不同的isoform，其中一些exon的read counts较多，如图中三个较高的蓝色峰，且在两个样品间有明显的变化qpcr引物设计原则和注意事项，这三个峰所在的位置就适合设计引物。
怎样拿到序列呢？
点击IGV里的这个小图标
，然后在你感兴趣的区段左边点一下鼠标，右边点一下鼠标，就出现红色的那一段了，在红色区域点右键，copy sequence，粘贴到你的引物设计软件里，就OK啦！
栗子二
对于链特异性建库的lncRNA-seq数据，每个sample有Forward和Reverse两个track，分别代表正义链和反义链，你能看到两条链上转录出来的不同的转录本。
下图这个lncRNA位于一个蛋白编码基因的antisense（箭头标明转录方向），虽然gene结构注释认为lncRNA位于内含子区域，但其下游仍有较多的read分布，可能是基因结构注释的问题。
我标出红色的区域跟另一个基因的exon没有重叠。
这里的四个track，分别是第一个sample的Forward和Reverse，和第二个sample的Forward和Reverse。两个sample的Reverse间有明显的差异，可用来设计引物。
最后，用哪个软件设计引物？
推荐primer3，，简单高效。
Product Size Ranges限制为80-150，其余全部默认。我的经验是它设计出来的第一对引物就好用。
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