微生物学家在对抗白色念珠菌的耐药和生物膜形成过程中面临着巨大的困难。每一个白色念珠菌都是一个“二倍体”生物，因为它通常包含两份完整的基因组，其中含有所有编码基因。然而，为了了解一个特定基因所起的作用，研究人员需要能够同时删除这两个副本，让他们能够观察到基因完全缺失的影响，这在白色念珠菌中是一个困难的挑战。此外，在许多过程中，基因经常扮演非常相似甚至是多余的角色，包括耐药性和菌膜的形成，这意味着不止一个基因需要被删除，以识别那些功能相关联的基因。
为了突破白色念珠菌基因缺失的挑战，一个协作的团队由哈佛大学生物工程研究所两位核心导师James Collins和George Church领导，他们已经开发出一种基于CRISPR-Cas9的“基因驱动”平台，所创建的二倍体品系病原体，其基因副本可以有效地删除。
这项技术可能会引导人们更好地了解药物耐药性和菌膜形成机制，并通过未来的研究，可以帮助确定新的药物靶点和联合疗法。
这项研究发表在《Nature Microbiology》上。
研究小组利用最近发现的一种罕见的“单倍体”白色念珠菌，与其他真菌一样，它只包含一组染色体，每个基因都只有一个副本，但它们可以被交配，很容易地形成二倍体形式。“我们使用了单倍体白色念珠菌菌株，并替换了我们想要用‘基因驱动’来消除的基因，我们之前开发了的，并调节到特定生物学状态的白色念珠菌。在交配之后，这些‘自私的基因分子’开始取代在二倍体真菌中正常的基因拷贝，”哈佛大学医学院真菌的繁殖方式，哈佛大学和麻省理工学院的遗传学教授Church博士说。“这种方法运作得如此有效，以至于我们甚至可以通过高通量同时删除对不同基因的配对，并探索它们的功能是否相关。”
这种新的基因驱动方法是基于CRISPR - Cas9系统，在这一系统中，一种DNA切割的Cas9酶靶向两个区域，位于单倍体白色念珠菌真菌中一个基因的两侧，由两个所谓的“向导RNA”(gRNAs)基因组成。在靶向基因序列被切断后，一种基因驱动的盒式表达，将所有的Cas9和gRNA组件插入其位置。当两个单倍体菌类交配形成二倍体后代时，基因驱动也将替代基因在另一个染色体上的对应基因，得到目标基因有效地从机体完全删除的原始版本。
通过应用他们的基因删除方法，研究小组能够识别出在对抗某些药物或触发菌膜形成过程中协同作用的基因组合。
“例如，删除两种外排泵编码基因CDR1 和CDR2，或TPO3 和CDR2真菌的繁殖方式，呈现白念珠菌对氟康唑和其他抗真菌药物高度敏感，表明针对两种机制可以帮助克服耐药性,”Rebecca Shapiro博士，她是Collins团队的博士后。Shapiro和Alejandro Chavez合作，是这篇文章的第一作者。Chavez曾是一名博士后，曾与Church 和 Collins一起工作;他现在是纽约哥伦比亚大学的助理教授。“在生物膜形成过程中，我们还发现ALS3粘附因子基因的丧失与其他几种粘附因子基因的丧失协同作用，这使得它成为一个高度互联的菌膜粘附的枢纽，可以作为进一步探索的有趣候选靶点。”
这项研究为了解白色念珠菌疾病的的发病机制和耐药性提供了新的途径。“我们现在可以得到一个更好操控的遗传网络，用于研究构成白色念珠菌的有害性是如何形成的，看他们如何应对特定环境和药物干扰，从而发现新的漏洞，在未来可能引领新的药物靶点和联合疗法的发现”，Collins博士说。
此外，他们的基因驱动阵列平台可以成为其他真菌病原体类似方法的蓝图，比如那些新出现的念珠菌，因为具有很强的抗药性，而被疾病控制和预防中心标记，列为威胁。当我们完全掌握了真菌耐药的机制，并能有效地通过基因驱动消除对应的基因，那么，耐药性对于人类健康的威胁将得到很大程度上的缓解。
参考资料：
[1] Driving drug resistance out of fungi
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