circRNA（环状RNA）是通过特殊的选择性剪切产生封闭环状结构的非编码RNA。circRNA不受RNA外切酶的影响，比线性RNA表达更稳定。研究表明，某些特殊的circRNA分子富含 miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA sponges(海绵)的作用，进而解除 miRNA 对其靶基因的抑制作用。如：ciRS-7(CDR1a)包含 63 个保守的 miR-7结合位点，该circRNA在细胞中能够有效吸附miR-7。而miR-7 作为关键调节因子广泛参与癌症途径，如抑制在乳腺癌、胶质瘤等。这些研究暗示ciRS-7通过ceRNA(competing endogenous RNAs)机制调节miR-7的功能，是神经系统疾病和癌症治疗的潜在靶点。
一般测序的结果出来以后，还需要进一步验证某circRNA在某组织中的表达，基本方法有qPCR，Northern blot和原位杂交（ISH），其中qPCR最为简介方便成本低，可以用于预实验中表达的初步鉴定，当然结果好的话本部分结果也是可以放在文章中的，因此本期小编就介绍一下circRNA qPCR的基本注意事项及引物设计。
CircRNA定量PCR实验流程有以下六步：
1、样品RNA抽提
2、RNA质检
3、RNA逆转录cDNA
4、cirRNA特殊引物设计
5、cirRNAPCR扩增
6、PCR结果分析
样品RNA：用于circRNA的定量研究的RNA严格来讲是需要三无的，既无基因组DNA，无核糖体RNAqpcr引物设计原则和注意事项，无线性RNAqpcr引物设计原则和注意事项，但也有人提出来说只需要前面两个“无”也可以。（具体方法小编近期会出专题，敬请关注）
反转录过程：需用随机引物（pd(N)6 和pd(N)9 都可以）进行反转录，一定不能用oligdT引物反转录,原因很简单，circRNA没有3’polyA尾。
PCR过程：PCR中最重要的就是引物设计了，circRNA的引物（Divergent PCR ）与线性mRNA的引物（convergent PCR）设计方向刚好是相反的，如下图：
首位相接，大概300bp左右，就是环化后的结构，用NCBI primer blast 或primer5进行引物设计，设计原则依据实时定量PCR的引物原则。
这样设计出来的引物是divergentprimer，可以通过以下方法验证该环状RNA的存在，同一样品，提取基因组DNA，以及RNA，设计的普通引物（convergent）以上两组均可以扩出，但divergent 基因组上扩不出来，只有环化后首位相接的circRNA才能扩出来，这样就证明了此序列在体内存在环化形式，即存在circRNA。
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